Participación de Investigadores Civiles y Veterinarios Militares Españoles en el Experimento Espacial BIOMEX (Biology and Mars Experiment) con la Agencia Espacial Europea (ESA) / Participation of Spanish Civil Researches and Spanish Military Veterinarians in the BIOMEX Space Experiment (Biology and Mars Experiment) with the European Space Agency (ESA)

The BIOMEX experiment (Biology and Mars Experiment, ILSRA 2009-0834) was part of the SUBLIMAS project (acronym for "Survival of bacteria and lichens in analogues of Mars and space"), led by INTA and funded by the Ministry of Science, Innovation and Universities (ESP2015-69810-R). The main objective of the SUBLIMAS project is the study of the survival and degradation of extremophilic organisms (lichens among others) in space and in simulated conditions of Mars in the long term. The results of this experiment showed that, after a long period of exposure in the EXPOSE-R2 installation on the International Space Station, the Circinaria gyrosa lichen was able to recover photosynthetic activity. It is of great interest to do studies in living organisms in extreme situations, as well as the need for collaborations between different institutions to carry them out. Highlight the participation of veterinarians of the Military Health Corps among other researchers, as well as the learning generated after participating in coordinated projects. These fndings extend knowledge about the resistance of life to space conditions and contribute to the understanding of the adaptation potential of extremophilic organisms to the environmental conditions of the Martian Surface

El experimento BIOMEX (Biology and Mars Experiment), ILSRA 2009-0834 formó parte del proyecto SUBLIMAS (acrónimo de "Supervivencia de bacterias y líquenes en análogos de Marte y en el espacio"), liderado por el Departamento de Observación de la Tierra del INTA-Campus de Torrejón y fnanciado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Modalidad 1, Proyectos I+D+i del Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación, orientado a los Retos de la Sociedad, referencia ESP2015-69810-R). En este proyecto participa personal del Área de Defensa Biológica (INTA-Campus La Marañosa, España) y entre el mismo dos ofciales veterinarios del Cuerpo Militar de Sanidad con la especialidad complemen-taria de Microbiología, Higiene y Sanidad ambiental. También participa el Instituto de Geociencias (IGEO-CSIC, España), el Institute of Planetary Research (DLR, Alemania), el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS-CSIC, España) y la Umea University (Suecia)

Desarrollo de un método de detección de Ocratoxina A (OTA) mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución con Detector de Masas en Tiempo de Vuelo / Development of a method for the Ochratoxin A (OTA) detection by High Resolution Liquid Chromatography with Time Mass Detector

Antecedentes: La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por algunos hongos (Aspergillus y Penicillium). Puede aparecer en diversos alimentos dependiendo de las condiciones de producción y almacenamiento. Presenta propiedades carcinógenas, nefrotóxicas, teratógenas, inmunotóxicas y neurotóxicas. Es tóxica por inhalación y por ingestión, presenta una elevada estabilidad y su obtención es relativamente sencilla, pudiendo representar un serio problema de salud pública y seguridad. Por ello existe la necesidad de desarrollar métodos de detección rápidos y específicos, que contribuyan a garantizar la seguridad de los ciudadanos. En este sentido, la cromatografía líquida acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)) se revela como una técnica diagnóstica muy adecuada para conseguir una detección rápida y específica de dicha micotoxina. Objetivo: Desarrollo de un método de detección de OTA, rápido y específico mediante HPLC-MSD (TOF). Material y Métodos: Se realizaron 36 ensayos con diferentes condiciones cromatográficas y espectrométricas. En todos los casos se utilizó un HPLC 1200 y un MSD-TOF 6210, con fuente de ionización electrospray (Agilent Technologies). Resultados: El cromatograma obtenido mostró el pico de OTA a un tiempo de retención de 1,791 ± 0,009 minutos. En su espectro de masas se observa el ion molecular [M+H]+ a 404,07986 uma y su perfil isotópico característico. Conclusiones: El método optimizado mediante HPLC-MSD (TOF) para la detección de OTA es rápido y específico. Este método podría ser adecuado para la detección de otras toxinas, permitiendo crear una base de datos para toxinas susceptibles de ser utilizadas como agentes bioterroristas

Antecedents: Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by some fungi (Aspergillus y Penicillium). It can be found in several types of food, depending on both production and storage conditions. It has carcinogenic, nephrotoxic, teratogenic, immunotoxic and neurotoxic properties. It is toxic by inhalation and by ingestion. Since this toxin has a high stability and its extraction is relatively simple, it represents a serious public health and safety problem. Therefore, in order to help ensure the safety of all the citizens, it is necessary to develop a fast and sensitive ochratoxin detection method. In this sense, liquid chromatography coupled to a time-of-flight mass detector (HPLC-MSD (TOF)) is revealed as a very suitable diagnostic technique to achieve a rapid and specific detection of this mycotoxin. Aim: Development of a fast and specific method of OTA using HPLCMSD (TOF). Material and Methods: Thirty-six assays were tested with different chromatographic and spectrometric conditions. In all the assayed cases, HPLC 1200 and an MSD (TOF) 6210 with electrospray ionization source were used, (Agilent Technologies). Results: The chromatogram obtained showed the peak of OTA at a retention time of 1,791 ± 0,009 minutes. In its mass spectrum it is observed both the molecular ion [M+H]+ at 404,07986 uma and its characteristic isotopic profile. Conclusions: The OTA detection method optimized by HPLC-MSD (TOF) is fast and specific. This method could be suitable for the detection of other toxins, allowing the creation of a database for toxins suspected of being used as bioterrorist agents (or biological warfare agents)

Diseño de oligonucleótidos sonda para la detección de virus de interés en biodefensa / Oligonucleotide probes design for the detection of interesting in biodefense viruses

ANTECEDENTES: Los virus causan enfermedades en el hombre como la gripe, la rabia, la fiebre amarilla o la fiebre hemorrágica. Además, presentan características como alta variabilidad genética, virulencia y fácil transmisión y producción con infraestructuras mínimas, lo que les convierte en un problema de salud pública y de bioseguridad. Por todo ello, desarrollar sistemas de biodetección precisos y versátiles es un reto ante el cual, la tecnología de micromatrices de ADN, se presenta como un sistema de ideal. OBJETIVOS: Diseño de oligonucleótidos sonda para la detección de especies pertenecientes a nueve familias de virus de interés en biodefensa. Material y MÉTODOS: Se seleccionaron familias de virus de interés en biodefensa, se buscaron los genomas completos de los virus de referencia de cada una de ellas en las bases de datos (GenBank) y se identificaron fragmentos de 60 nucleótidos que cumplieran determinados condicionantes estructurales, evaluándose con BLASTN su capacidad de hibridación cruzada. RESULTADOS: Se obtuvieron los genomas de referencia de virus pertenecientes a nueve familias. Se diseñaron un total de 54 nucleótidos sonda, seis de ellos correspondientes al virus de la gripe A tipo H1N1 y se clasificaron las secuencias según su índice de identidad, permitiendo predecir la capacidad diagnóstica de las sondas diseñadas. CONCLUSIONES: Se han encontrado secuencias suficientes para identificar nueve familias de virus, de interés en la biodefensa, mediante la tecnología de hibridación de micromatrices de ADN

BACKGROUND: Viruses cause human diseases such as influenza, rage, yellow fever and hemorrhagic fever. In addition, they have characteristics such as high genetic variability, virulence and easy transmission and production with minimum level of infrastructure, which make them not only a public health but also a biosecurity problem. Therefore, the development of accurate and versatile biodetection systems is a challenge in which DNA microarray technology is released as an ideal system. OBJECTIVES: Probe design for virus detection by microarray technology. MATERIALS AND METHODS: Virus families with interest in biodefense were selected and the complete genomes of the reference viruses were searched in the databases (GenBank). Fragments of 60 nucleotides with some specific physical characteristics were identified. Finally, cross-hybridization capacity was also evaluated with BLASTN software. RESULTS: Viral genomes from nine families were obtained. A total of 54 probe nucleotides were designed, six of them corresponding to influenza A type H1N1 virus and the sequences were classified according to their identity index, allowing to predict the diagnostic capacity of the designed probes. CONCLUSION: It has been found enough sequences to identify nine virus families with interest in biodefense by means of the DNA microarray technology

Optimización del proceso de inmovilización de anticuerpos en inmunobiosensores / Optimization of the antibody immobilization process in immunobiosensors

Antecedentes: La detección rápida y específica de agresivos biológicos es fundamental en diversos campos como control ambiental, diagnóstico clínico, industria alimentaria, seguridad y defensa. La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo es empleada en multitud de biosensores, como equipos de identificación de agentes de guerra biológicos, pero el cómo se una ese anticuerpo en la superficie del biosensor, en términos de densidad, orientación, y estabilidad determinará la capacidad diagnóstica del dispositivo. Objetivo: Desarrollo de procesos de inmovilización de anticuerpos en superficies planares que permitan una unión antígeno-anticuerpo eficiente, para su posterior uso en dispositivos inmunológicos de sensado. Material y Métodos: Se ensayaron tres métodos de inmovilización del anticuerpo-fluoresceína sobre una membrana Zprobe: adsorción pasiva, unión covalente con glutaraldehído (0,5 %) y unión orientada con proteína mediadora A/G (5 y 10 µg). Se seleccionó albúmina sérica bovina-ficoeritrina como simulante de toxina proteica. Resultados: El porcentaje de retención del anticuerpo inmovilizado durante el proceso de inmunocaptura fue similar en los métodos ensayados. La densidad del anticuerpo inmovilizado fue mayor en la inmovilización con glutaraldehído y menor con proteína A/G. Sin embargo, respecto a la eficiencia de la inmunocaptura del antígeno, la inmovilización del anticuerpo con glutaraldehído fue la menos eficiente frente a la inmovilización con proteínas A/G, que resultó ser la más eficaz. Conclusiones: La utilización de glutaraldehído en la inmovilización del anticuerpo, aunque incrementa la densidad de unión del mismo sobre una membrana Zprobe, interfiere en el proceso de inmunodetección antigénica, mientras que el uso de la proteína mediadora A/G permiten un sistema de inmunocaptura más eficiente, con una menor densidad de anticuerpo inmovilizado

Antecedent: A quick and specific detection of biological warfare agent is the keystone in several fields like environmental control, clinic diagnostic, food industry, security and defence. The specificity of antigen-antibody binding is used in a multitude of biosensors like biological warfare-agent detection equipment. However, how the antibody is attached to the biosensor surface, in terms of density, orientation and stability, will determine the diagnosis capability of the device. Aim: the development of antibodies immobilization proceedings in planar surface for an efficient antigen-antibody reaction to be used in immunological sensing devices. Material and Methods: three immobilization methods of fluorescein labelled antibody were assayed on Zprobe membrane: passive adsorption, covalent bond by glutaraldehyde, well-oriented immobilization by the intermediate protein A/G. Bovine serum albumin labelled with R-phycoerytrin was selected as toxin surrogate. 0,5 % glutaraldehyde and A/G chimeric protein (5 and 10 µg) were used as immobilization reactive. Results: immobilized antibody retention during the immunocapture process was similar between all the assayed immobilization methods. The immobilized antibody density by glutaraldehyde was higher than that by protein A/G. However, with regard to the antigenic immune-capture efficiency antibody immobilization by glutaraldehyde was the less efficient than immobilization by protein A/G. Conclusions: Antibody immobilization by glutaraldehyde, in spite of increasing the retained antibody density on the Zprobe membrane, interferes in the antigenic immunodetection whereas the intermediate protein A/G improves it, allowing a very efficient immunocapture system with less antibody density

Optimización y Validación de una PCR en Tiempo Real para la Rápida Identificación de Bacillus thuringiensis, Simulador de Bacillus anthracis / Optimization and validation of a real-time PCR for rapid identification of Bacillus thuringiensis, surrogate of Bacillus anthracis

INTRODUCCIÓN: Bacillus anthracis es uno de los agentes de guerra biológica más empleados en el mundo. Sin embargo, en los laboratorios de defensa biológica es conveniente utilizar en muchas ocasiones otras bacterias parecidas a Bacillus anthracis pero menos peligrosas o apatógenas. Uno de los principales simuladores de Bacillus anthracis es Bacillus thuringiensis, debido a su elevada homología con B. anthracis y a su nula patogenicidad para el ser humano. OBJETIVOS: El objetivo del presente estudio es desarrollar y validar una PCR en tiempo real para la rápida identificación del ADN de Bacillus thuringiensis, agente empleado muy a menudo en los simulacros para entrenamiento de las Unidades Operativas de toma de muestras NBQ de las FAS. Material y MÉTODOS: La identificación del simulador Bacillus thuringiensis se ha realizado mediante la amplificación y detección con una sonda de hidrólisis de un fragmento de 69 pares de bases del gen cry1A, el cual es específico de esta bacteria. Tras optimizar las condiciones de amplificación probando tres temperaturas diferentes de hibridación/extensión, se procedió a realizar la validación del método desarrollado. RESULTADOS: La nueva PCR en tiempo real desarrollada presentó una eficiencia del 93%, así como una elevada linealidad (coeficiente de regresión R2 0,9993). El límite de detección al 95% de probabilidad fue de 13 equivalentes de genoma completo por reacción. Tanto la inclusividad como la exclusividad del método fueron del 100%. CONCLUSIONES: El método molecular desarrollado por el Laboratorio de Biología Molecular del INTA permite una rápida identificación del ADN de Bacillus thuringiensis, simulador de Bacillus anthracis, con unas elevadas sensibilidad y especificidad analíticas

INTRODUCTION: Bacillus anthracis is the most employed biological warfare agent in the world. However, in biological defense laboratories, many times it is convenient to use other bacteria similar to Bacillus anthracis but less dangerous or non-pathogenic. One of the main surrogates of Bacillus anthracis is Bacillus thuringiensis, due to its high homology with B. anthracis and its null pathogenicity for humans. OBJECTIVE: The objective of the present study is to develope and validate a real-time PCR for the rapid identification of Bacillus thuringiensis DNA, biological agent very often employed in the training of the Operative Units of CBRN sampling of the Armed Forces. METHODS: The identification of Bacillus thuringiensis has been performed by the amplification and detection with a hydrolysis probe of a 69 base pairs fragment of the cry1A gene, which is specific for this bacterium. After optimizing the amplification conditions by testing three different hybridization / extension temperatures, the validation of the new developed method was carried out. RESULTS: The new developed real-time PCR showed an efficiency of 93%, as well as a high linearity (regression coefficient R20.9993). The limit of detection at 95% probability was 13 genome equivalents per reaction. Both the inclusiveness and the exclusivity of the method were 100%. CONCLUSIONS: The molecular method developed at the Molecular Biology Laboratory of INTA allows the rapid identification of Bacillus thuringiensis DNA, surrogate of Bacillus anthracis, with a high analytical sensitivity and specificity

Simulacro de Actuación de las Unidades Operativas NRBQ / Training exercise of CBN Operating Units

Antecedentes: Ante la creciente amenaza terrorista, la mayoría de los países han creado Unidades Operativas especializadas en la lucha contra armas de destrucción masiva (ADM). Uno de los puntos críticos en un incidente bioterrorista es la detección e identificación precoz de estos agentes, para lo cual es imprescindible realizar una adecuada toma de muestras, conservación, transporte y custodia de las mismas hasta el laboratorio de referencia. Objetivo: Valorar el entrenamiento de las Unidades de toma de muestras NBQ mediante la realización de simulacros. Lugar de realización: Área de Defensa Biológica del Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial «Esteban Terradas» (INTA). Diseño: Se presenta la preparación y desarrollo de un ejercicio de entrenamiento de los Equipos de Reconocimiento (RECO) y de Muestreo e Identificación de Agentes Biológicos, Químicos y Radiológicos (SIBCRA en inglés) del Regimiento de la Defensa NBQ Valencia I (RGTO DNBQ Valencia I). Resultados: Se obtienen muestras NBQ y se evalúa la eficacia de la operativa de la toma de muestras, transmisión de los datos y coordinación general del ejercicio (AU)

Antecedents: Due to the merging terrorist threat, most of the countries have created specialized operating units to fight weapons of mass destruction. One of the critical points in a bioterrorist incident is the early detection and identification of these agents. In this sense, it is essential to perform appropriate procedures for sampling, storage, transportation and custody of them until the reference laboratory. Objective: to train the different NBC Units by means of simulacrums. Place of performance: Biological Defense Area of the National Institute of Aerospace Technique "Esteban Terradas" (INTA). Design: This paper shows the preparation and development of a training exercise of Reconnaissance teams (RECO) and Sampling and Identification of Biological, Chemical and Radiological Agents teams (SIBCRA) from NBC Defense Regiment Valencia I. Results: NBQ samples are obtained and the efficiency of the operations, sampling, data transmission and general coordination of the exercise is evaluated (AU)

Protocolo para la identificación rápida y sensible de ricina en muestras ambientales ante una alerta biológica / Protocol for rapid and sensitive identification of ricin in environmental samples during a biological alert

Introducción: La ricina es una toxina muy potente que ha adquirido importancia por su potencial uso como arma biológica, fundamentalmente en forma pulverulenta. El desarrollo de métodos que permitan una detección rápida y temprana tras la exposición a la toxina permitiría reducir las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas. Ante una alerta/amenaza biológica con una muestra sospechosa de contener ricina, la Red de Laboratorios de Alerta Biológica (RELAB), infraestructura de naturaleza científico-técnica creada mediante la Orden PRE/305/2009, autoriza el envío de la muestra al Instituto Nacional de Técnica Aerospacial (INTA), uno de los laboratorios de referencia que integran esta Red. Objetivos: Desarrollo de un protocolo para la detección de ricina basado en una doble detección, un ensayo inmunológico y un análisis proteico, para aumentar la fiabilidad del diagnóstico además de acortar sensiblemente el tiempo de respuesta del laboratorio. Material y Métodos: El diagnóstico inmunológico con anticuerpos in house combinados en un ELISA tipo Sandwich. El diagnóstico proteico mediante la técnica SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) para determinar el tamaño y la estructura de las distintas proteínas de la muestra. Resultados: La optimización del marcado de los anticuerpos de detección, así como la preparación y almacenamiento de placas previamente tapizadas/bloqueadas permite conseguir un ensayo muy sensible (<1 ng/mL) en un tiempo inferior a cuatro horas. Conclusión: La realización de ambos ensayos en paralelo permite disponer de un método diagnóstico robusto, sensible y rápido (AU)

Introduction: Ricin is a powerful toxin wich has gained importance due to its potential use as biological weapon, essentially in powder form. The development of methods that promote a rapid detection after the toxin exposure will allow us to reduce its associated rates of both mobility and mortality. In the face of biological threat with samples suspected of containing ricin, the Biological-Alert-Laboratory-Network (RELAB), which is a scientific-technical infrastructure created by the Order of the Ministry of the Presidency PRE/305/2009, authorizes the shipment of this type of samples to the National Institute of Aerospace Technique (INTA), one of the Reference Laboratory belonging to this Network. Aim: Development of one protocol to detect ricin based on both an immunological assay and a protein analysis focused to reduce noticeably the response time of the laboratory. Material and Methods: The Immunological diagnosis of ricin uses in house antibodies combined in an ELISA sandwich. Protein diagnosis through the SDS-PAGE technique defines the size and structure of different proteins contained in the sample. Results: The optimization of detection antibody labelling and the development of precoated-and-preblocked stored plates has allowed us to achieve a very sensitive assay (<1 ng/mL) less than four hours. Conclusion: Carrying out both assays in paralell enables us to have a hardy, sensitive and rapid method to identify ricin (AU)

PCR cuantitativa en tiempo real para la amplificación de ADN de Burkholderia mallei: comparación con el método molecular recomendado por la OIE / Quantitative PCR in real time to Burhholderia mallei ADN amplification: A comparison with the molecular method recommended by OIE

Objetivo principal: Comparar dos PCRs en tiempo real cuantitativas para la identificacion de Burkholderia mallei, en terminos de sensibilidad y especificidad analiticas. Metodología: Amplificacion parcial de genes de B. mallei:- orf11 y orf13 del sistema de secreción de tipo III TTS1 del genero Burkholderia mediante qPCR con sondas de hibridacion. - fliP que codifica para la flagelina P de B. mallei mediante qPCR con sonda TaqMan. Calculo de parametros de validez. Resultados: El ensayo desarrollado en el laboratorio obtuvo un limite de deteccion del orden del obtenido con el metodo recomendado por la OIE (70,4 fg/reaccion) y permitio la amplificación especifica de ADN de B. mallei. Conclusión: El metodo desarrollado por el laboratorio de Biologia Molecular del INTA permite una rapida amplificacion de ADN de B.mallei con unas elevadas sensibilidad y especificidad analiticas. Ademas, posibilita la diferenciacion entre B. mallei y B. pseudomallei (AU)

Objective: Comparison of two quantitative real-time PCRs for identification of Burkholderia mallei, on analytical sensitivity and specificity terms. Methods: Partial amplification of Burkholderia mallei gene: - orf11 and orf13 targeting the type III secretion TTS1 system cluster from Burkholderia genus by qPCR using hybridisation probes. - fliP targeting flageling P from B. mallei by qPCR by using TaqMan probe. Validity parameters determination. Results: The duplex test developed by the Molecular Biology Laboratory at INTA obtained a limit of detection similar to that reached by the molecular method recommended by the OIE and permitted the specific amplification of B. mallei DNA. Conclusions: The duplex test developed by the Molecular Biology Laboratory at INTA provides a rapid amplification of B. mallei DNA. It also shows high analytical sensitivity and specificity. Furthermore, this test permits the differentiation between B. mallei and B. pseudomallei (AU)